化学成分明确的人源hESC/iPSC无饲养层培养基
来源:    发布时间: 2013-11-07 14:03   1413 次浏览   大小:  16px  14px  12px
化学成分明

化学成分明确的人源hESC/iPSC无饲养层培养基

——从实验室到临床的跨越
 
    自从人类的胚胎干细胞(ESC)和诱导多能性干细胞(iPSC)出现以来,将它们应用于人类的疾病治疗就成了广大科研工作者不懈的奋斗方向。由hESC/iPSC直接分化出组织和器官,替换病变的部位,能够突破当今传统医药学无法逾越的极限。然而,目前hESC/iPSC的研究和应用依然局限在实验室范围内,其中一个重大因素就是配方复杂、成分不明确的hESC/iPSC培养基。
    培养基中的动物源成分是阻碍干细胞应用于临床的最主要因素。
    最早期的hESC/iPSC培养基都含有胎牛血清(Fetal Calf Serum, FBS)。FBS是从胚胎期10至14天的小牛的血液中直接提取的血清,内含血浆蛋白、多肽、生长因子、激素等多种因素。去除FBS中促使ESC/iPSC分化的成分,得到化学成分更确定的血清替代物,这就是KOSR(Knockout Serum Replacement)。然而,无论是FBS还是KOSR,其来源都是成分复杂的自然提取物,使用它们配成的培养基会带来许多不利影响。
    首先,FBS和KOSR中含有的未知成分的作用不明确,会对细胞产生多方面的复杂影响:如影响ESC和iPSC的状态,使得细胞克隆形态松散,边缘趋向于分化;影响ESC和iPSC的多能性,降低它们的分化潜能;屏蔽细胞与外源因子的相互作用或影响细胞内的代谢和信号传递,使某些药物的功能试验无法进行,甚至得到谬误的结果。
    其次,自然提取物的质量无法稳定控制,使得每一批次的培养基效果不一致,实验的重复性不高。低质量的培养基甚至会对ES/iPS细胞系的状态产生负面的不可逆影响。
再次,FBS和KOSR都是动物的提取物,并且其培养的ESC/iPSC依赖于小鼠的饲养层(feeder)(人源的饲养层来源稀少、价格昂贵)。人类的ESC和iPSC长期在动物来源的培养基中培养,可能会发生适应性的改变,使得它们在应用到人体中时产生免疫排斥、功能不全等不良结果。
    首次去除hESC/iPSC培养体系中的动物血清成分的培养基是mTeSR1培养基,它含有19种成分,几乎完全使用了人类来源的重组蛋白和有机化合物代替了血清。然而其中的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA),使得mTeSR1培养基仍存在动物来源的不确定因素。
2011年,威斯康辛大学麦迪逊分校Morgridge研究所的Chen等在Nature Methods上发表文献称,在mTeSR1培养体系中去除了β-巯基乙醇后,BSA的存在变得没有必要。他们进一步测试了培养基中其它成分的作用,最后得到了一种只由8种成分组成的hESC/iPSC培养基,并将之命名为E8(Chen et al., 2011)。
E8培养基是一种化学成分完全明确的、所含蛋白均为人重组蛋白的无饲养层(feeder-free)培养基。由E8培养基培养得到的hESC/iPSC,具有优于血清培养体系下的hESC/iPSC的克隆形态、多能性干细胞marker表达以及向各个胚层分化的能力,与mTeSR1培养得到的hESC/iPSC没有明显差别。E8培养基支持hESC和iPSC的feeder-free培养,配合人重组vitronectin基质铺皿,可以得到比在Matrigel上培养更紧密、形态更规则的克隆。
    据以往研究结果,培养基中含有的各个成分都对细胞具有不止一种作用(多态性),有些作用可能还不为人们所知,而成分之间以及它们产生的下游信号之间的相互作用产生的影响更为错综复杂。因而仅含有8种成分的E8培养基对细胞的未知影响更小,较其它培养基在细胞功能试验上更具优势。
最后,E8培养基所含的8种成分的生产过程都是可控的,因而不同批次的培养基质量一致,经测试不同批次的E8培养基培养的得到的ESC/iPSC都具有相同的最佳多能性特征。并且细胞可以直接从非E8培养体系转入E8培养体系,而不产生适应的迟滞期。
    在干细胞研究的临床推进之路上,E8培养基有着得天独厚的优势,这预示着由此产生的培养方法,将成为干细胞培养的主流技术。具体的优势可以总结为:化学成分明确、无动物源成分、支持无饲养层培养;培养得到的hESC/iPSC克隆形态规则、紧密、不易分化,多能性marker高表达,并具有向三胚层分化的能力;简单的组分减少了对细胞自身生化过程的影响、避免了对进行测试的外部因子和药物作用的干扰;不同批次的培养基质量稳定、可重复性高,是目前最为优秀的应用于临床级别hESC/iPSC培养的培养基。
E8培养基需与其相应的试剂组成培养体系,得到最佳的培养效果,例如用人重组vitronectin铺皿、用无酶的温和消化液传代等。商业化的改良E8培养基及其配合的培养试剂在Cellapy、STEMCELL和Life Technology公司有售卖。
    Cellapy作为国内唯一的干细胞试剂与技术服务公司,提供高质量的PSCeasy多能性干细胞培养体系。Cellapy拥有更具竞争力的价格、更快的供应链、以及更周全的技术指导服务(北京市范围内可提供现场技术培训)。
 
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【参考文献】
Chen, G., Gulbranson, D.R., Hou, Z., Bolin, J.M., Ruotti, V., Probasco, M.D., Smuga-Otto, K., Howden, S.E., Diol, N.R., Propson, N.E., et al. (2011). Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods 8, 424-429.